Невирусные средства доставки генетических конструкций на основе синтетической хромосомы человека в клетки млекопитающих: 2021 г. этап 2

  • Томилин, Алексей Николаевич (PI)
  • Sinenko, Sergey (CoI)
  • Пономарцев, Сергей Вячеславович (CoI)

Project: Grant fulfilmentTotal grant fulfilment

Project Details

Description

Разработка тканезаместительной геннотерапевтической модели на основе альфоидных искусственных хромосом человека (альфоидные-ИХЧ) и плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) для лечения моногенных наследственных заболеваний, таких как гемофилия, имеет важное научно-практическое значение в современной биомедицине. 

Разработка и усовершенствование новых ММСТ методов переноса альфоидных-ИХЧ в клетки млекопитающих, а также альтернативных методов переноса хромосом является приоритетом в данной области. Ограниченное количество лабораторий в мире владеет техникой создания терапевтических альфоидных-ИХЧ и методами переноса и манипуляции искусственными хромосомами. 

Используемый нами вид ИХЧ, имеющих в своих центромерных областях встроенные tetO-связывающие сайты (это позволяет обеспечить индуцируемую потерю ИХЧ), не был детально охарактеризован на предмет их использования в генотерапевтических целях.

Данный проект нацелен на разработку и создание новых генотерапевтических конструкций на основе ИХЧ, оценки эффективности их работы в модельной системе мыши, тканезаместительной генотерапии гемофилии.

В результате проведенных исследований на данном этапе получены следующие результаты:

Layman's description

Работа направлена на создание генотерапевтических векторов на основе новосинтезированной альфоиднойТетО-искусственной хромосомы человека (аИХЧ). Данные аИХЧ имеют ряд преимуществ в сравнении с нехромосомными генетическими векторами, так они позволяют вносить в себя большие участки ДНК генов, бесконечно поддерживаться и передаваться в дочерние клетки при этом не повреждая генома и функционирования клетки хозяина.
Есть ряд генетических наследственных заболеваний которые вызваны повреждением одного гена. Такие заболевания можно лечить с помощью внесения копии "здорового" гена в клетки полученные от больного пациента. аИХЧ являются такими генетическими средствами которые позволяют доставить и наследовать копию "здорового" гена в клетках. Синтезированные аИХЧ практически не исследованы как векторы для лечения таких заболеваний. Одним из таких заболеваний является гемофилия-А. В наших исследованиях мы разрабатываем генотерапевтическую модель лечения гемофилии-А у мышей с помощью аИХЧ и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

Key findings for the project

1) Получены конструкты на основе альфоидных-ИХЧ, несущие следующие кДНК фактора FVIII человека под контролем промотора EF1-alpha. Клонированные последовательности кДНК FVIII вставлены в альфоидные-ИХЧ с помощью Cre/lox системы в клетках СНО.
2) Из фибробластов мышей мутантных по гену фактора FVIII получены иПСК мыши, подтверждена их плюрипотентность. Приготовлены лентивирусы, кодирующие полицистронную OKSM и rT-TA репрограммирующие конструкции.
3) Отработаны методы ММСТ для переноса альфоидных-ИХЧ; и произведен перенос альфоидных ИХЧ, несущих FVIII трансген, в иПСК гемофильных мышей.
4) Проведены эксперименты, подтверждающие эффективную экспрессию трансгенов в целевых иПСК, несущие соответствующие ИХЧ конструкты.
5) Определена митотическая стабильность альфоиднойTetO-ИХЧ-EF1α-FVIII-CAG-GFP в ИПСК мыши. Митотическая стабильность данной хромосомы является низкой, что не позволяет ее использование в генотерапевтических целях.
6) Проведено субклонирование 2 клонов ИПСК, содержащих альфоиднуюTetO-ИХЧ-EF1α-FVIII-CAG-GFP с целью обнаружение наиболее митотически стабильных клонов. Выявлено несколько субклонов в которых данная хромосома поддерживалась наиболее стабильно, однако этого недостаточно для ее использования в генотерапевтических целях.
7) Разработан подход и начата работа по модификации конструкции альфоиднойTetO-ИХЧ-EF1α-FVIII-CAG-GFP в конструкцию, содержащую EF1α-FVIII-IRES-GFP.


Публикации:
1. Sinenko S.A., Ponomartsev S.V., Tomilin A.N. Pluripotent stem cell‑based gene therapy approach: human de novo synthesized chromosomes.
Cellular and Molecular Life Sciences. 2020 Oct 3. doi: 10.1007/s00018-020-03653-1; Q1. IF=9.26

2. Ponomartsev S.V.; Sinenko S.A.; Skvortsova E.V.; Liskovykh M.A.; Voropaev I.N.; Savina M.M.; Kuzmin A.A.; Kuzmina E.Y.; Kondrashkina A.M.; Larionov V.; Kouprina N.; Tomilin A.N. Human alphoid-tetO artificial chromosome as a gene therapy vector for the developing hemophilia A model in mice.
Cells. 2020 Apr 3;9(4):879. doi: 10.3390/cells9040879; Q2. IF=6.6

Обзорная статья на стадии подготовки.
Искусственные хромосомы человека: технология получения и перспективы развития.

Key findings for the stage (in detail)

Сборка векторов для доставки терапевтического гена в альфоиднуюTetO-ИХЧ.
С помощью методов молекулярного клонирования нами ранее были получены генетические вектора для доставки гена FVIII в альфоиднуюTetO-ИХЧ (конструкции CMV-tDNA-optFVIII и EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII) (Рис. 1). Элементы, общие для обоих конструкций – это: ориджин репликации, необходимый для наработки данных векторов в бактериальных клетках; ген устойчивости к ампициллину для отбора на селективной среде бактериальных клонов, содержащих такие плазмиды; сайт loxP для сайт-специфичного встраивания векторных конструкций в альфоиднуюTetO-ИХЧ; 3’ фрагмент гена гипоксантин-гуанин фосфорибозил трансферазы (HPRT), который после встраивания векторов в альфоиднуюTetO-ИХЧ в правильной ориентации, обеспечивает восстановление функциональной формы гена HPRT, что позволяет отбирать клоны клеток линии CHO, нокаутные по гену HPRT, но несущие его восстановленную форму в ИХЧ, на селективной НАТ среде (Holliday & Ho, 1998); ген зелёного флуоресцентного белка GFP под контролем повсеместного промотора CAG (Hitoshi et al., 1991), как дополнительный маркер селекции клеток; кДНК гена фактора свёртывания крови VIII; кластеры тДНК в качестве инсуляторов (Ebersole et al., 2011; Lee et al., 2013; Raab et al., 2012), которые фланкируют гены GFP и FVIII, для предотвращения ингибирующего влияния на транскрипцию трансгенов со стороны центрохроматина, после встраивания векторных конструкций в альфоиднуюTetO-ИХЧ.
Конструкции различаются между собой по промоторам, контролирующим экспрессию гена FVIII, а именно в векторе pCMV-tDNA-optFVIII – это промотор цитомегаловируса (CMV), а в конструкции pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII – это повсеместный промотор гена альфа субъединицы фактора элонгации 1 человека (EF1-α). Также в конструкции pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII между промоторами генов GFP и FVIII, которые расположены в ориентации «голова к голове» находится дополнительный инсулятор cHS4 куриного β-глобулинового кластера генов, необходимый для разграничения их активности.

Встраивание трансгенов в альфоиднуюTetO-ИХЧ с помощью cre/lox-рекомбинации.
Генетические векторные конструкции pCMV-tDNA-optFVIII и EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII были ранее встроены в альфоиднуюTetO-ИХЧ, находящуюся в HPRT-/- клетках линии СНО, с помощью сайт-специфичной Cre/lox-рекомбинации (детали в отчете 2020) (Рис. 2).
После Cre/lox рекомбинации генетического вектора pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII и альфоиднойTetO-ИХЧ, на селективной НАТ-среде нами было ранее получено 2 клона клеток линии СНО, содержащих терапевтическую альфоиднуюTetO-ИХЧ, и экспрессирующих флуоресцентный зелёный протеин GFP, и белковый продукт гена FVIII. Было показано с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), что в обоих клонах терапевтическая альфоиднаяTetO-ИХЧ присутствует в одной копии и находится в автономном состоянии. Также ранее с помощью Cre/lox рекомбинации был получен и аналогично охарактеризован СНО клон, содержащий альфоиднуюTetO-ИХЧ с pCMV-tDNA-optFVIII конструкцию.

Мышиные FVIII-/--ИПСК, содержащие альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ.
Ранее с помощью метода ММСТ было получено 8 клонов мышиных FVIII-/--ИПСК клеток, содержащих альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ, позитивных по флуоресцентному зелёному GFP сигналу (отчет 2020г). Мы установили, что клетки только 2 клонов, которые были получены с помощью метода ретроММСТ, способны экспрессировать ген фактора свёртывания крови VIII (клоны №1 и 2). На основе анализа метафазных пластинок с помощью флуоресцентной гибридизации in situ было показано, что альфоиднаяTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ присутствует в этих клетках в автономной форме. Ранее проведенный анализ также показал, что данные ИПСК остаются полностью плюрипотентными, экспрессируют Nanog и Oct4 и образуют полноценные тератомы в иммуно-дефицитных мышах.

Анализ функциональной активности белка FVIII, экспрессирующегося с ИХЧ.
Также нами был проведён функциональный тест для определения активности белка FVIII в культуральной среде при содержании клеток в условиях in vitro и в плазме крови мышей при подкожных трансплантациях полученных нами клеточных клонов, содержащих ИХЧ-EF1-α-F8. Для измерения активности белка FVIII в культуральной среде, на чашки одновременно высевали одинаковое количество клеток CHO-ИХЧ-EF1-α-F8, CHO-ИХЧ-CMV-F8, ИПСК-ИХЧ-EF1-α-F8 (кл. №1), ИПСК-ИХЧ-EF1-α-F8 (кл. №2), а также исходные клоны СНО 38.18 и FVIII-/- ИПСК в качестве отрицательного контроля. Через двое суток отбирали образцы культуральной среды и с помощью специального фирменного набора Chromogenix Coamatic Factor VIII (Diapharma, Уэст Честер, США) измеряли активность белка FVIII, используя спектрофотометр. С помощью данного подхода нам удалось зарегистрировать активность белка FVIII в культуральной среде из чашек с клетками CHO-ИХЧ-EF1-α-F8, однако показатели других образцов не превышали показателей отрицательных контролей (данные не представлены). Эти данные могут указывать, что данный трансген, являющейся секретируемым растворимым белком, не секретируется плюрипотентными стволовыми клетками в связи с отсутствием у них данной функции или разрушается как чужеродный белок. Дальнейшие исследования будут направлены на исследование секреции FVIII в дифференцированных клетках полученных из данных ИПСК.

Анализ митотической стабильности FVIII-альфоиднойTetO-ИХЧ в ИПСК
Митотическая стабильность ИХЧ является одним из важных характеристик требуемых для использования в качестве генотерапевтических векторов, и представляет собой частоту потери хромосомных единиц ИХЧ в процессе клеточного деления. В связи с этим мы провели оценку показателя потери альфоиднойTetO-ИХЧ за день в клетках ИПСК-ИХЧ-EF1-α-FVIII (клоны 1 и 2), ИПСК-ИХЧ-CMV-FVIII, а также мышиных эмбриональных стволовых клетках, содержащих альфоиднуюTetO-ИХЧ с геном GFP под контролем промотора CAG в качестве трансгена (ЭС-ИХЧ-GFP), полученных ранее в нашей лаборатории (Liskovykh et al., 2015) (Рис. 3). Для оценки данного показателя использовался стандартный протокол (Ikeno et al., 1998)(Pesenti et al., 2018). Клетки выращивали в течение 20 суток на среде с добавлением бластисидина (4 мкг/мл), после этого, когда большая часть клеток, не содержащих альфоиднуюTetO-ИХЧ оказывается элиминирована из культуры, отбирали часть клеточного материала для его анализа с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и проточной цитофлуориметрии (FACS), остальные клетки продолжали выращивать на среде без бластисидина. Через 15 дней ещё раз отбирали клетки для их анализа теми же методами (Рис. 3). С помощью проточной цитофлуориметрии определяли процент позитивных по зелёному флуоресцентному GFP сигналу клеток в культуре (соответственно тех клеток, в которых содержится альфоиднаяTetO-ИХЧ с активным GFP-трансгеном) (Табл. 1). С помощью флуоресцентной гибридизации in situ зондов, специфичных к альфоиднойTetO-ДНК и препаратов метафазных пластинок, определяли процент клеток, содержащих в геноме альфоиднуюTetO-ИХЧ (Табл. 2). Полученные показатели позволили рассчитать показатель суточной потери клетками альфоиднойTetO-ИХЧ (Табл. 1 и 2).
Дополнительно, мы оценивали динамику накопления GFP-негативных клеток в клонах ИПСК-ИХЧ-EF1-α- FVIII (клоны № 1 и 2), культивируемых в среде без добавления бластисидина, таким образом косвенно анализируя динамику спонтанной потери клетками альфоиднойTetO-ИХЧ. Для этого, с помощью флуоресцентного сортера, мы отбирали только GFP-позитивные клетки и высевали их на чашки. В процессе культивирования с помощью проточной цитофлуориметрии оценивали количество GFP-позитивных клеток через 8, 18 и 22 дней после изначального посева на чашку (Рис. 4, а). По полученным данным был построен график (Рис. 4, б). На основании полученных Исходя из данных, видно, что в ходе культивирования клеток на среде, не содержащей селективного агента, в обоих рассматриваемых клонах происходит постепенная потеря экспрессии гена ЕGFP с искусственной хромосомы. Причинами являются (1) потеря ИХЧ в процессе деления клеток, (2) эпигенетическое «глушение» трансгена и (3) перестройки ИХЧ или встраивание ИХЧ в геном хозяина (хромосомные аберрации).

Отбор линий ИПСК с повышенной стабильностью ИХЧ.
Одним из подходов улучшения характеристик ИХЧ применимых для генотерапевтических целей является поиск наиболее стабильной ИХЧ или ИХЧ содержащего клона с помощью раундов субклонирования. С этой целью мы субклонировали две клона ИПСК-ИХЧ-EF1α-FVIII-ЕGFP, содержащих промотор EF1α, обеспечивающий достаточную экспрессию целевого трансгена.
В процессе субклонирования из популяции клеток клона 1 линии ИПСК-HAC-EF1α- FVIII-ЕGFP было отобрано 9 клонов с максимальной светимостью EGFP. Данный показатель мы рассматривали как индикатор наличия ИХЧ и отсутствия глушения трансгенов. Отметим, что клон Е2 светился наиболее ярко, а клоны А1, А9 и Е1 к концу эксперимента имели наиболее слабое свечение.
Из популяции ИПСК клона 2 линии PS-HAC-EF1α-FVIII-ЕGFP было отобрано 8 клонов с максимальной светимостью. Наибольшей светимостью обладал клон В6. Из каждого отобранного клона был получен препарат метафазных пластинок и проведена флуоресцентная in situ гибридизация для оценки качества искусственной хромосомы в полученных клонах.
В субклонах А5 и А9 клона 1 ИПСК-ИХЧ-EF1α-FVIII-ЕGFP не наблюдалось светимости, однако содержали интактную ИХЧ и приближенный к норме кариотип. Были отобраны клоны Е2 и В6, обладающие стабильной экспрессией GFP и повышенной стабильностью ИХЧ (64% и 57% соответственно). Кроме того интересно заметить значительную вариацию в наборе хромосом между разными субклонами, что может говорить о генетической нестабильности ИПСК в культуре а также не исключает возможной ограниченностью данного метода анализа кариотипа. Таким образом, на сновании вышеприведенных данных можно заключить, что ИХЧ-EF1α-FVIII-ЕGFP не отвечает требованиям терапевтического вектора, а именно не обладает митотической и структурной стабильностью и устойчивой экспрессией трансгена.

Разработка модифицированной конструкции FVIII-IRES-GFP.
В связи с низким уровнем экспрессии FVIII в ИПСК и ИПСК-производных тканях мы решили модифицировать вектор EF1α-FVIII-ЕGFP путем инактивации CAG промотора и встраивания сразу за FVIII последовательностью IRES-EGFP последовательность, что позволит экспрессироваться обоим трансгенам FVIII и EGFP с одного сильного и повсеместного промотора EF1α. Данная конструкция позволит наблюдать совместную экспрессию данных трансгенов в различных типах клеток и оценить специфичность или способность экспрессии фактора FVIII в данных клетках. На рисунке 5 приведены карты исходного - pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII и модифицированного векторов - pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII-IRES-GFP-bov-glo-polyA2A (CAG-).

Key findings for the stage (summarized)

1)Определена митотическая стабильность альфоиднойTetO-ИХЧ-EF1α-FVIII-CAG-GFP в ИПСК мыши. Митотическая стабильность данной хромосомы является низкой, что не позволяет ее использование в генотерапевтических целях.
2)Проведено субклонирование 2 клонов ИПСК, содержащих альфоиднуюTetO-ИХЧ-EF1α-FVIII-CAG-GFP с целью обнаружение наиболее митотически стабильных клонов. Выявлено несколько субклонов в которых данная хромосома поддерживалась наиболее стабильно, однако этого недостаточно для ее использования в генотерапевтических целях.
3)Разработан подход и начата работа по модификации конструкции альфоиднойTetO-ИХЧ-EF1α-FVIII-CAG-GFP в конструкцию, содержащую EF1α-FVIII-IRES-GFP.

Academic ownership of participants (text description)

Томилин Алексей Николаевич - разработка проекта, планирование экспериментов, написание статей и отчетов.
Синенко Сергей Анатольевич - разработка проекта, планирование экспериментов, написание статей и отчетов, выполнение экспериментов и анализ полученных результатов.
Пономарцев Сергей Вячеславович - выполнение экспериментов и анализ полученных результатов, написание статей и отчетов.

Transfer of the full copy of the report to third parties for non-commercial use: permitted/not permitted

Разрешается

Check of the report for improper borrowing in external sources (plagiarism): permitted/not permitted

Разрешается
Short titleGZ-2021
AcronymМ1_2020 - 2
StatusFinished
Effective start/end date23/03/2131/12/21

Fingerprint

Explore the research topics touched on by this project. These labels are generated based on the underlying awards/grants. Together they form a unique fingerprint.