Научная стажировка в рамках проекта GRISC в Университете Ганновера, Германия

Project: Grant fulfilmentTotal grant fulfilment

Project Details

Layman's description

Проект направлен на разработку и исследование свойств систем доставки малой интерферирующей РНК (миРНК) с целью лечения глазных заболеваний.

Основным препятствием для доставки миРНК является нестабильность молекулы в физиологических условиях и быстрое снижение концентрации после введения. Решением данной проблемы может стать создание наноразмерных систем для инкапсулирования миРНК и пролонгирования ее высвобождения.

Химическая часть этого проекта выполнена в Институте химии Санкт-Петербургского государственного университета. В более ранних исследованиях были синтезированы и исследованы наночастицы из полипептидов, имеющих в составе 60% положительно заряженной аминокислоты (лизин), 25% отрицательно заряженной (глутаминовая кислота) и 15% гидрофобной аминокислоты (фенилаланин или изолейцин). Было установлено, что подобные образцы способны эффективно инкапсулировать миРНК, а высвобождение миРНК происходит в течение 120 часов.

В ходе данного проекта автор планирует более тщательно исследовать влияние ранее полученных образцов на различные клеточные линии и изучить процессы проникновения частиц в клетки. Кроме того, запланирована модификация указанных образцов гистидином, положительно заряженной аминокислотой, которой свойственен эффект «протонной губки», что способствует более интенсивному высвобождению лекарственного препарата из полимерных частиц и предполагает их большую эффективность в качестве внутриклеточных систем доставки.

Синтез новых полимерных материалов планируется разработать и оптимизировать в Институте химии СПбГУ. Полимерные наночастицы будут получены и всесторонне охарактеризованы. Также будет разработана и оптимизирована процедура инкапсулирования нуклеиновых кислот.

В рамках научного проекта автор намерен разработать и провести биологические исследования ряда наночастиц в качестве систем доставки нуклеиновых кислот. Разнообразный биологический анализ полученных образцов поможет выбрать наиболее эффективную систему с точки зрения ее дальнейшего возможного применения в лечении глазных заболеваний.
Для этого планируется изучить кинетику поглощения наночастиц клетками, токсичность наночастиц относительно нескольких клеточных линий и эффективность доставки миРНК в клетки, экспрессирующие флуоресцентный белок GFP. Предполагается, что указанные эксперименты будут проводиться с использованием клеточных линий макрофагов, печени, почек и сетчатки. Биологическая часть проекта может быть реализована в сотрудничестве с Ганноверским университетом имени Лейбница в рамках программы G-RISC.

Key findings for the project

Химические эксперименты в СПБГУ (Санкт-Петербург, Россия):
В ходе научного проекта был осуществлен синтез и проведена полная характеризация статистических сополимеров аминокислот. Для создания сополимеров были выбраны следующие аминокислоты: лизин (положительно заряжен), глутаминовая кислота (отрицательно заряжена), фенилаланин и изолейцин (гидрофобны). После удаления защитных групп лизина и глутаминовой кислоты полимеры стали способны к самоорганизации в водных растворах. Модификация полученных полимеров гистидином была проведена за счет ковалентного связывания активированной карбоксильной группы гистидина и свободной аминогруппы лизина.
Были получены и охарактеризованы наночастицы. Размер частиц варьировался от 200 до 500 нм, согласно измерениям методами динамического рассеяния света (ДРС) и анализа траектории наночастиц (АТЧ). Влияние рН на поверхностный заряд и размер частиц зависело от соотношения аминокислот в составе сополимера. Частицы также были стабильны в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) на протяжении 7 дней.
Также были проведены эксперименты по инкапсуированию дуплекса олиготимидин-олигоаденин (oligo-dT-dA) – модели малой интерферирующей РНК. Эффективность его инкапсулирования составила более 99% при соотношениях полимер:oligo-dT-dA от 4:1 до 20:1.

Биологические эксперименты в университете Лейбница (Ганновер, Германия):
Принимающий ученый: профессор Томас Шепер; работа была выполнена в научной группе Антонины Лаврентьевой.
Синтезированные наночастицы были протестированы на цитотоксичность по отношению к клеткам печени и сетчатки. Было установлена, что частицы не проявляют токсичность в диапазоне концентраций до 64 мкг/мл, при этом образцы, модифицированные гистидином, являются менее токсичными по сравнению с другими полимерами. Это может объясняться тем, что количество лизина, которому свойственна токсичность, на поверхности частицы снижено за счет присутствия гистидина, соответственно, общая токсичность системы также уменьшается.
Была изучена кинетика поглощения наночастиц макрофагами. Было установлено, что все частицы захватываются макрофагами через 8 часов, при этом, присутствие гистидина способствует более интенсивному захвату. Это происходит из-за того, что поверхностный заряд частиц немного увеличивается. Из литературы известно, что время циркуляции частиц в кровотоке зависит от свойств поверхности носителя, при этом скорость захвата макрофагами возрастает с увеличением заряда. Это утверждение справедливо для полиаминокислотных наночастиц.
Был проведен эксперимент по внутриклеточной доставке миРНК. Клетки фибробластов, продуцирующие зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein – GFP), были использованы для тестирования эффективности нокдауна GFP-белка молекулами миРНК. Изначально в клетках регистрировалась существенная интенсивность флуоресценции GFP белка, но введение в них молекул миРНК, инкапсулированных в наночастицы, вызывало деградацию матричной РНК, что привело к торможению синтеза соответствующего флуоресцирующего белка. Согласно первичным экспериментам, эффективность систем, содержащих гистидин, была выше, что может быть обусловлено эффектом «протонной губки». Однако данный эксперимент необходимо провести повторно для получения статистически более точных результатов.

Таким образом, в рамках проекта G-RISC был осуществлен синтез и проведена полная характеризация статистических сополимеров аминокислот, получены и охарактеризованы наночастицы на их основе; изучены особенности инкапсулирования и высвобождения олигомеров нуклеиновых кислот. Подтверждена нетоксичность частиц различного состава в диапазоне концентраций 4-64 мкг/мкл для двух типов клеток. Изучена эффективность применения полипептидных частиц для доставки миРНК, а также исследована кинетика поглощения частиц макрофагами.
AcronymGRISC 2020_2
StatusFinished
Effective start/end date9/11/209/12/20