Лаборатория биомолекулярного ядерного магнитного резонанса: 2022 г. этап 10

  • Скрынников, Николай Русланович (PI)
  • Подкорытов, Иван Сергеевич (CoI)
  • Tiuriaeva, Irina (CoI)
  • Struts, Andrei (CoI)
  • Rogacheva, Olga (CoI)
  • Лузик, Дмитрий Александрович (CoI)
  • Бушманова, Елена Леонидовна (CoI)
  • Salikov, Vladislav (CoI)
  • Lebedenko, Olga (CoI)
  • Kharkov, Boris (CoI)
  • Михайловский, Олег Владимирович (CoI)
  • Корбан, Светлана Андреевна (CoI)
  • Селиванов, Станислав Иванович (CoI)
  • Levkina, Aleksandra (CoI)

Project: Grant fulfilmentGrant stage fulfilment

Project Details

Description

В Лаборатории биомолекулярного ЯМР СПбГУ сложились и развиваются следующие основные направления исследований: применение спектроскопии ЯМР и других биофизических методов в сочетании с методами компьютерного моделирования для исследования фундаментальных вопросов науки о белках; разработка новых ЯМР экспериментов и методов компьютерного моделирования для исследования белков; клеточные эксперименты для исследования пептидов и белков с потенциальным применением в области онкотерапии, а также лечения вирусных заболеваний; разработка методов определения белковых структур с использованием данных рентгеновской кристаллографии и ЯМР спектроскопии. На 2022 г. запланированы следующие работы. (1) Тестирование и валидация сервера DDfit для обработки данных диффузионных экспериментов ЯМР (https://ddfit.bio-nmr.spbu.ru). (2) Доработка протокола для интерпретации экспериментов иммуноферментного анализа по конкурентному связыванию. (3) Реализация моделей молекулярной динамики с применением новой модели воды OPC, позволяющей точно предсказывать диффузионные параметры белковых молекул. (4) Уточнение параметров силового поля для спиновой метки MTSSL, используемой в ЭПР и ЯМР спектроскопии белков. (5) Интерпретация данных парамагнитного усиления релаксации (PRE) в ядерной частице нуклеосомы на основе данных МД моделирования. (6) Определение границ подвижного участка пептидной цепи в амилоидах Sup35NM. (7) Реализация концепции диффузионного фильтра в образце, содержащем смесь фибрилл Sup35NM и мономерных фрагментов Sup35M. (8) Сравнительный анализ связывания пролин-содержащего пептида Sos1 и его ретро-инверсного аналога ri-Sos1 с N-концевым SH3 доменом адаптерного белка Grb2. (9) Создание модели эпителиальной ткани полости носа на основе клеточной культуры карциномы носовой перегородки RPMI 2650.
Описание
В Лаборатории биомолекулярного ЯМР СПбГУ сложились и развиваются следующие основные направления исследований: применение спектроскопии ЯМР и других биофизических методов в сочетании с методами компьютерного моделирования для исследования фундаментальных вопросов науки о белках; разработка новых ЯМР экспериментов и методов компьютерного моделирования для исследования белков; клеточные эксперименты для исследования пептидов и белков с потенциальным применением в области онкотерапии, а также лечения вирусных заболеваний; разработка методов определения белковых структур с использованием данных рентгеновской кристаллографии и ЯМР спектроскопии.
На 2022 г. запланированы следующие работы.
Цель 1. Тестирование и валидация сервера DDfit для обработки данных диффузионных экспериментов ЯМР (https://ddfit.bio-nmr.spbu.ru). Всестороннее тестирование будет проведено с использованием обширного набора экспериментальных данных (большое число коротких экспериментов с низким отношением сигнал-шум), а также имитационных наборов данных, полученных с помощью компьютерного моделирования.
Цель 2. Доработка протокола для интерпретации экспериментов иммуноферментного анализа (ИФА) по конкурентному связыванию, предлагаемых к использованию в качестве альтернативы для экспериментов изотермической титрационной калориметрии (ИТК). Нами будет представлена схема исследования методом ИФА, достаточно простая в применении, обеспечивающая хорошую воспроизводимость результатов и согласие (в пределах заявленной ошибки) с результатами измерений ИТК. Предлагаемая схема позволит определять константы диссоциации Kd порядка 0.1 нМ, которые не поддаются количественному определению с помощью метода ИТК.
Цель 3. Реализация моделей молекулярной динамики с применением новой модели воды OPC, позволяющей точно предсказывать диффузионные параметры белковых молекул. Мы прогнозируем, что использование модели OPC позволит с высокой точностью предсказать коэффициент трансляционной диффузии как для разупорядоченного пептида (N-концевой фрагмент гистона H4), так и для структурированного белка (убиквитин). Аналогичным образом, мы ожидаем, что применение этой модели позволит предсказать коэффициент вращательной диффузии для убиквитина, а также скорости спиновой релаксации N-H4, отражающие вращательную и конформационную динамику пептида.
Цель 4. Уточнение параметров силового поля для спиновой метки MTSSL, используемой в ЭПР и ЯМР спектроскопии белков. Мы рассчитываем, что репараметризация MTSSL с помощью методов квантовой химии и с привлечением силовых полей общего назначения позволит избежать артефактов, наблюдаемых в настоящее время при моделировании спин-меченых белков (а именно, спорадического связывания метки на перифирии гидрофобного ядра, сопровождающегося возмущением белковой структуры).
Цель 5. Интерпретация данных парамагнитного усиления релаксации (PRE) в ядерной частице нуклеосомы на основе данных МД моделирования. Недавно полученный массив экспериментальных данных состоит из четырёх наборов PRE, соответствующих четырём различным сайтам мечения (конъюгации с нитроксильной меткой MTSSL) в структуре гистона H3, с детекцией на остатках подвижного N-концевого участка гистона H4. Для анализа данных PRE будут использованы МД траектории ядерной нуклеосомной частицы, которые будут подвергнуты исследованию с помощью метода анализа главных компонент с целью выделения характеристических состояний. В качестве следующего шага мы планируем построить модель нуклеосомы в виде суперпозиции из множества состояний, где каждому состоянию будет приписан собственный вес. Набор весов будет подвергнут оптимизации с использованием метода максимальной энтропии таким образом, чтобы воспроизвести всю совокупность экспериментальных данных PRE.
Цель 6. Определение границ подвижного участка пептидной цепи в амилоидах Sup35NM. Подвижный участок цепи будет идентифицирован с помощью жидкостной ЯМР спектроскопии с использовнием импульсной последовательности 1H,15N-HSQC. Для отнесения спектральных сигналов будет выполнено 1H,15N-HSQC титрование образца Sup35M от условий, используемых для исследования амилоидного образца [Kishimoto et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 315, 739], к условиям, в которых было получено отнесение мономера Sup35NM [Ohhashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci US 115, 2389].
Цель 7. Реализация концепции диффузионного фильтра в образце, содержащем смесь фибрилл Sup35NM и мономерных фрагментов Sup35M. Эксперимент будет реализован с помощью системы градиентов Diff50, позволяющей генерировать градиент магнитного поля с амплитудой до 30 Т/м. Помимо двухкомпонентного образца будет использован также образец фибрилл Sup35NM с высокой степенью чистоты (двукратная очистка путём ультрацентрифугирования), а также контрольный образец Sup35M.
Цель 8. Сравнительный анализ связывания пролин-содержащего пептида Sos1 и его ретро-инверсного аналога ri-Sos1 с N-концевым SH3 доменом адаптерного белка Grb2. Мы планируем получить высокочистый образец пептида ri-Sos1, меченого парамагнитной меткой MTSSL в N-терминальной позиции. Используя этот материал, мы получим данные по парамагнитному усилению спиновой релаксации (PRE) для комплекса Grb2 N-SH3 с ri-Sos1. На основе этих данных и ранее полученных данных для ri-Sos1, конъюгированного MTSSL в C-терминальной позиции, мы рассчитываем валидировать имеющуюся в нашем распоряжении МД модель вышеозначенного комплекса. Опираясь на данные МД моделирования, мы также намерены оценить характерные времена ассоциации/диссоциации комплекса и сравнить их с экспериментальными данными, полученными методом ЯМР и изотермической титрационной калориметрии.
Цель 9. Создание модели эпителиальной ткани полости носа на основе клеточной культуры карциномы носовой перегородки RPMI 2650 с целью изучения её взаимодействия с терапевтическими белками. Для создания модели будут использованы специальные вставки, позволяющие моделировать рост ткани на интерфейсе воздух - жидкость. Исследуемые белки будут оснащены флуоресцентной меткой Atto 647 для наблюдения методом конфокальной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Предметом исследования станет взаимодействие белков с муциновой матрицей клеток, а также эффект проницаемости мембраны для малых белков.
Планируемое количество публикаций - 6 (в изданиях, индексируемых в WoSCC).
Short titleGZ-2022
AcronymMega_SPbU_2013 - 10
StatusActive
Effective start/end date1/01/2231/12/22