Исследование агрегации белков в условиях экзогенного стресса с помощью ЯМР и других физико-химических методов: 2019 г. этап 2

Project

Description

Множество возрастных заболеваний, главным образом в тканях с низкой регенерационной способностью (мозг, сердце, почки), связано с существованием белковых агрегатов. При старении совокупность каскадов взаимодействий, отвечающих за контроль качества белка, начинает допускать ошибки в работе. Часто постулируется, что дисбаланс гомеостаза белка является ключом к хронологическому старению многих дифференцированных типов клеток, а также приводит к более раннему проявлению нейродегенерации, амилоидозов и других подобных заболеваний в случае генетических мутаций. Отличительным признаком таких широко распространенных в развитых странах нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Альцгеймера [15,16], Паркинсона [17], боковой амиотрофический склероз [18], являются белковые отложения в нейронах и глиальных клетках. Эти заболевания могут иметь как наследственный, так и спорадический характер.
С другой стороны, амилоиды могут иметь нормальную биологическую функцию, как показано на примерах грибковых прионов, амилоидном белке Pmel17, который участвует в пигментации кожи млекопитающих, белке пролактине, гормоне роста и инсулиноподобном факторе роста-I [19–21]. Было обнаружено, что пептидные и белковые гормоны в секреторных гранулах эндокринной системы хранятся в амилоидоподобной конформации, богатой структурами β-листов. Таким образом, функциональные амилоиды в гипофизе и других органах могут способствовать нормальной физиологии клеток и тканей.
В то время как биологические молекулы могут быть деградированы несколькими способами, присутствие агрегатов в биофармацевтических препаратах остается одним из основных вопросов качества и безопасности. Не во всех агрегатах теряется функциональность исходного белка, но по мере того, как происходит агрегация, активность составляющих белковых молекул может значительно уменьшаться или исчезать совсем. Еще большее беспокойство вызывает то, что многочисленные исследования показали наличие нежелательного и/или потенциально опасного иммунного ответа у реципиента, когда в лекарственных средствах, предназначенных для парентерального введения, присутствуют агрегаты белка.
Наиболее серьезной проблемой безопасности является возможность вызвать иммунный ответ, приводящий к анафилактическому шоку. Менее разрушительные иммунные реакции также имеют серьезные последствия. Например, эффективность биофармацевтического препарата может быть скомпрометирована, если иммунный ответ у пациента приводит к деградации терапевтического белка, что приводит к неэффективному лечению, возможно, там, где нет других альтернативных методов лечения. Не менее важным является введение белков, предназначенных для повышения уровня природного эндогенного белка. Вызов иммунного ответа здесь может привести не только к разрушению самого терапевтического средства, но также может вызвать иммунный ответ против внутреннего белка, потенциально подвергая пациента дополнительным клиническим осложнениям. Случай Эпрекс-ассоциированной чистой эритроцитарной аплазии является хорошо документированным примером такого эффекта [22].
В то же время в некоторых технологических процессах производства биопрепаратов агрегация может быть полезным процессом. В качестве варианта замещения сложного процесса хроматографической очистки целевого белка из клеточного лизата возможно селективное осаждение белка с помощью полиэлектролитов или полимеров [23]. Однако при производстве рекомбинантных белков условия при экспрессии и очистке могут быть не оптимальными, что приводит к потере белкового материала в агрегированном состоянии при фильтрации. Такие потери имеют последствия как в увеличении необходимого труда, так и в увеличении материальных затрат на химикаты, электричество и т.д. Это увеличивает рыночную цену и без того дорогостоящих белковых лекарственных средств.
Исследование причин агрегации белков и способов управления этим процессом в живых системах и в промышленных технологиях, является актуальной задачей, поскольку умение управлять агрегацией позволит улучшить качество жизни людей, удешевить производство лекарственных препаратов на основе рекомбинантных белков, а также сделать применение таких лекарств более безопасным.
На данный момент агрегация, полимеризация и кристаллизация белков представляют собой процессы, которыми сложно управлять предсказуемым (неэмпирическим) образом. В первом приближении, разумеется, есть эмпирические и интуитивно понятные способы управлять агрегацией белков, однако при более детальном рассмотрении проблемы открывается ее сложность и многогранность. Научная новизна проекта заключается в нацеленности на более глубокое понимание комплекса процессов, включающих агрегацию, полимеризацию и кристаллизацию белков, на основе комплементарного использования ЯМР и других физико-химических методов.
В литературе описано большое количество исследований агрегации белков с помощью наблюдения макроскопических и микроскопических характеристик растворов, а также отслеживания поведения молекул растворителя и белка. Тем не менее, описания общей согласованной картины взаимодействий, структурных и динамических параметров системы с белковой агрегацией пока еще не существует. Мы предлагаем исследовать белковую агрегацию различного типа с помощью современных и хорошо зарекомендовавших себя методов ядерного магнитного резонанса на ядрах растворителя, белка, а также ионов в буферных растворах. На основании совместной интерпретации данных ЯМР спектроскопии и ЯМР релаксации для всех молекулярных компонентов раствора будет произведен поиск путей решения описанных проблем с агрегацией белков. Для проверки согласованности построенных моделей будут проведены дополнительные исследования другими физико-химическими методами.
И кубинская, и российская стороны заинтересованы в изучении процессов агрегации белков, а также поведения гидратационной воды при агрегации. Для коллег кубинской стороны из Центра генной инженерии и биотехнологии это является насущной проблемой в промышленном фармацевтическом производстве. Агрегация белков изучалась ранее (см. научный задел) обеими сторонами и представляет собой общую точку интереса. Мануэль Лорес, Карлос Кабаль и Хуан Гарсиа посвятили много лет работе над изучением полимеризации гемоглобина S и имели успех в разработке диагностических тестов для мониторинга состояния людей больных серповидноклеточной анемией. Севастьян Рабдано и Дмитрий Лузик опубликовали фундаментальную статью по агрегации домена RRM2 белка TDP-43 в условиях окислительного стресса. Обмен опытом по исследованию этих систем, а также обмен образцами и возможностью проводить экспериментальные измерения на оборудовании, доступном обеим группам, будут гарантировать наличие синергетического эффекта при совместных исследованиях.
Ученые российской стороны владеют фундаментальными знаниями и имеют большой опыт работы в области магнитного резонанса и работы с белковыми образцами. В распоряжении российской группы есть развитая материальная и методологическая база для изучения агрегации белков. У кубинской стороны есть понимание поставленной биофизической проблемы и большой опыт работы в области прикладной биомедицины. И в России, и на Кубе есть биотехнологическое производство, заинтересованное в изучении агрегации белков.
Как уже было отмечено, руководитель кубинской стороны, профессор К. Кабаль был аспирантом В.И. Чижика и защитил кандидатскую диссертацию в Ленинградском государственном университете. К. Кабаль проводил исследования растворов ионов в России (СССР) в течении нескольких лет. В.И. Чижик посещал Кубу с лекциями и для проведения научных исследований. Кубинское физическое общество наградило В.И. Чижика за большой вклад в развитие методов ЯМР на Кубе (в феврале 2018 года) специальным дипломом. В 2017-2018 годах Профессор К. Кабаль участвовал в 3-х конференциях “Magnetic resonance and its applications (SPINUS)”, которые ежегодно организует профессор В.И. Чижик. Все это демонстрирует дружественные и конструктивные отношения между коллективами: наличие успешного опыта совместной работы в прошлом, большое желание укрепления связей и развития научно-исследовательской работы в будущем.

Исследования будут проводиться по адресу ул. Ботаническая, д. 17 в помещениях лаборатории биомолекулярного ЯМР.
AcronymRFBR_Cuba_2018 - 2
StatusActive
Effective start/end date14/11/1931/10/20