Интерполиэлектролитные комплексы для внутриклеточной доставки генетических конструкций: 2019 г. этап 1

Project: Grant fulfilmentGrant stage fulfilment

Description

Более 4500 болезней определены как генетически обусловленные заболевания. Классификация генетически детерминированных заболеваний может быть представлена в упрощенном виде: моногенные и полигенные заболевания. Моногенные заболевания – обусловленные мутацией одного гена. Мутации возникают в регуляторных или смысловых участках гена и приводят к нарушению транскрипционных и трансляционных процессов. Это, в свою очередь, обуславливает прекращение или уменьшение синтеза необходимого белка или же изменение его структуры и свойств. Полигенные заболевания – возникают в сочетании действий нескольких генетических и средовых факторов. Такие заболевания более сложны для генетического анализа, поскольку обусловлены мутациями в нескольких генах, каждая из которых не является причиной патологии, а их появление сильно зависит от модифицирующего влияния факторов внешней̆ среды. Наблюдается значительный клинический полиморфизм заболеваний. Проявления этих заболеваний зависят от возраста больного, эндокринного фона, питания и других факторов как внешней̆, так и внутренней̆ среды (сахарный диабет, ожирение, дерматозы, аутоиммунные заболевания и др.). Большинство распространённых в настоящее время заболеваний, такие как рак, атеросклероз, нейропсихиатрические болезни имеют существенный «генетический компонент» и также могут рассматриваться, как полигенные заболевания.
Генная терапия имеет большие перспективы для лечения заболеваний, предоставляя гены, кодирующие терапевтические белки. Несмотря на то, что первоначально разработки в данной области были направлены на лечение тяжёлых наследственных генетических расстройств, таких как муковисцидоз, гемофилия, тяжёлый комбинированный иммунодефицит, фенилкетонурия, мышечная дистрофия Дюшенна и др., проводимые в последнее время исследования расширили возможности применения генной терапии. В современной литературе есть исследования, описывающие возможность использования генетических конструкций для лечения ВИЧ, рака (1) и заживления ран (2).
Помимо возмещения недостатка функциональной формы недостающего или дефектного белка при многих заболеваниях (рак, сосудистые патологии, воспаления и др.) патологическое состояние, напротив, обусловлено гиперпродукцией того или иного белка. Например, в случае некоторых онкологических заболеваний и при глаукоме происходит перепроизводство фактора роста эпителия сосудов (VEGF). В подобных случаях перспективно использовать терапевтические системы на основе олигонуклеотидов, способных гибридизоваться с матричной РНК гиперэксперессирующегося гена, снижая те самым уровень его трансляции и, соответственно, количество белка, вызывающего патологию. Подобные олигонуклеотиды называются «антисмысловыми». Также, «выключение генов» возможно с использованием синтетических малых интерферирующих РНК (миРНК), которые интерферируют с матричной РНК, вызывая в конечном счёте её деградацию. К преимуществам миРНК относят их малый размер, который обуславливает низкую иммуногенность, и однозначность биологической мишени, которая способствует эффективности терапевтического действия.
Как в случае генной терапии, например, с использованием плазмидных ДНК, так и при подходе, основанном на РНК интерференции, важной проблемой остаётся доставка генетической конструкции внутрь клетки к месту её действия. Очевидно, что свободные плазмиды и миРНК не могут быть введены в организм ввиду их быстрой деградации под действием иммунной системы. Кроме того, при введении в ткани, генетическая конструкция неизбежно сталкивается с такими критическими барьерами, как сложность интернализации в клетки, в частности по причине отрицательного заряда клеточной мембраны и поли-/олигонуклеотидов. Поэтому, успешное применение обсуждаемых терапевтических подходов напрямую зависит от возможности использования специальных систем доставки. Наибольшей эффективностью при этом обладают вирусные векторы, обладающие тем не менее потенциально более высокой опасностью для пациентов. Безопасность и простота изготовления невирусных векторов для внутриклеточной доставки плазмид и миРНК являются их конкурентными преимуществами. При этом, нерешенной научной проблемой является достижение невирусными системами аналогичной эффективности трансфекции, как и в случае вирусных векторов. Было предложено множество типов носителей генетических конструкций, таких как полиаминокислоты, дендримеры, липосомы, белки, биосинтетические и природные полимеры. Все перечисленные носители обладают одним сходством – они могут иметь множество положительно заряженных групп в своей структуре, и поэтому способны связывать ДНК посредством электростатических взаимодействий с образованием полиэлектролитного комплекса. Однако большинство из них имеют ограничения в эффективности связывания ДНК (напр. биосинтетические полимеры: поли(молочная кислота) и др.), часто оказывают цитотоксический эффект (напр. поли-L-лизин, поли(этиленимин), дендримеры) и имеют низкую эффективность поглощения клетками (напр. липосомы, белки). Таким образом, научная проблема, на решение которой направлен данный проект, состоит в создании системы доставки генетических конструкций внутрь клетки, приближающихся по своей эффективности к вирусным векторам.
При использовании генотерапевтического подхода in vivo очень важно, чтобы комплексы носителя и НК проникали только в нужные типы клеток. Свойство избирательности появляется у носителя НК при добавлении в его структуру лиганда к определенному типу рецепторов. Именно способность носителя проникать в клетки путем рецептор-опосредованного эндоцитоза дает возможность нацелено воздействовать на причину заболевания. Понятие рецептор-опосредованного эндоцитоза было сформулировано в 1974 и поясняло регуляцию клеточного метаболизма холестерина. В настоящее время данный механизм активно используется в генной терапии. Процесс рецептор-опосредованного эндоцитоза комплексов носитель-НК невозможен без наличия в структуре носителя лиганда, выбор которого зависит от типа клеток-мишеней. Чаще остальных используются лиганды с низким молекулярным весом, такие как гликозиды. Было показано, что присоединение галактозида к полилизину повышает его способность приникать в клетки печени. Также часто в качестве лиганда используется трипептидный мотив - RGD, найденный в белках внеклеточного матрикса и специфически связывающийся с рецепторами - интегринами (Harbottle et al.,1998).
Интегрины представляют собой трансмембранные рецепторы клеточной адгезии. Все интегрины являются гетеродимерами, состоящими из α-и β-субьединиц. α-субъединицы различаются по размеру (Hynes, 1987). В среднем их вес составляет от 120 до 180 кДа. Каждая α-субьединица связана нековалентной связью с β-субьединицой, вес которой варьирует от 90 до 110 кДа. Многие α-субьединицы способны связываться только с одной β-субьединицой, в то время как одна β-субьединица имеет возможность присоединять несколько α-субьединиц. В настоящее время обнаружено около двадцати различных типов интегринов. Интегрины экспрессируются на различных клетках, и большинство этих клеток содержит несколько типов интегринов (Hemler, 1990).
Привлекательной мишенью при создании носителей для тканеспецифичной доставки нуклеиновых кислот в клетки эндотелия с целью подавления неоангиогенеза в опухолях является интегрин αvβ3. Продемонстрирована вовлеченность интегрина avβ3 в ангиогенез различных новообразований, в том числе твердых опухолей. Интегрин avβ3 присутствует на поверхности клеток эндотелия в норме, однако его экспрессия возрастает многократно при опухолевом процессе. Показано, что интегрин avβ3 играет ключевую роль в морфогенезе эндотелиальных клеток. Взаимодействие интегрина avβ3 с лигандами детально изучено. На настоящий момент разработано несколько синтетических лигандов, связывающих интегрин avβ3 с высокой аффиностью, в то числе циклический RGD пептид - c(RGDfK). Показано, что оптимальное связывание одной молекулы интегрина avβ3 происходит при взаимодействии рецептора с двумя пептидами c(RGDfK). Структура кольца повышает способность лиганда связывать интегрин αvβ3 за счет обеспечения пространственной доступности лиганда для рецептора. Кроме того циклический пептид более устойчив к деградации по сравнению с линейным аналогом. В тоже время, установлено, что комплексы с лигандом к av-интегринам в большинстве случаев накапливаются вокруг сосудов опухолей и слабо мигрируют в паренхиму опухоли. В недавних исследованиях был разработан пептидный лиганд iRGD, проникающий в опухоли. Он в своем составе помимо трипептидного фрагмента RGD содержит последовательность для связывания с мембранным белком нейрофиллином-1, который участвует в транспорте комплексов внутрь опухоли.
AcronymRSF_MOL_RG_2019 - 1
StatusActive
Effective start/end date15/08/1930/06/20