Изучение механизмов нитрат-опосредованной регуляции развития симбиотических клубеньков у гороха посевного (Pisum sativum L.) и люцерны слабоусеченной (Medicago truncatula Gaertn.) с использованием геномных технологий: 2020 г. этап 1

  • Zhukov, Vladimir (PI)
  • Жернаков, Александр Игоревич (CoI)
  • Штарк, Оксана Юрьевна (CoI)
  • Кулаева, Ольга Алексеевна (CoI)
  • Lebedeva, Mariia (CoI)
  • Додуева, Ирина Евгеньевна (CoI)
  • Яшенкова, Ярославна Сергеевна (CoI)
  • Dvornikova, Kristina (CoI)

Project: Grant fulfilmentGrant stage fulfilment

Project Details

Description

Цель данного этапа проекта - идентификация регулируемых нитратом пептидов CLE и CEP у люцерны слабоусеченной Medicago truncatula и у гороха посевного Pisum sativum, а также описание молекулярных механизмов их действия при клубенькообразовании и развитии растения. Задачами проекта на данном этапе являлись: 1) Секвенирование геномов четырех линий гороха посевного, 2) Идентификация генов, кодирующих пептиды CLE и CEP, в геноме гороха; оценка профиля их экспрессии, 3) Оценка уровней экспрессии генов CLE и CEP у люцерны и гороха при клубенькообразовании и при обработке нитратом с помощью количественной ПЦР в реальном времени, 4) Создание конструкций для cверхэкспрессии генов CLE и CEP у гороха и люцерны.

Layman's description

Пептиды CEP и CLE являются пептидными гормонами растений, регулирующими рост и развитие растений в зависимости от их азотного статуса. На данном этапе работы в геноме гороха посевного были выявлены гены, кодирующие пептиды CEP и CLE, и был оценен профиль их экспрессии в различных органах и тканях растения. В частности, уровень экспрессии генов, кодирующих данные пептиды, был определен у растений с азотфиксирующими клубеньками на корнях, а также у растений, обработанных нитратом. В результате были выявлены гены, экспрессия которых ассоциирована с клубенькообразованием и с обработкой экзогенным нитратом. Кроме этого, для изучения детальной роли данных генов были созданы генно-инженерные конструкции для cверхэкспрессии генов CLE и CEP у гороха, а также модельного растения люцерны.

Key findings for the project

-

Key findings for the stage (in detail)

В соответствии с поставленными задачами, на данном этапе работы было проведено секвенирование геномов четырех линий гороха посевного. Сырые данные секвенирования были получены путем прочтения библиотек на одной дорожке прибора Illumina NovaSeq6000 в режиме 2x150, paired end. С использованием полученных данных были идентифицированы гены, кодирующие пептиды CLE и CEP, и описано их разнообразие. В референсном геноме гороха сорта Frisson с использованием программы SPADA были идентифицированы 15 последовательностей гороха, кодирующих CEP-пептиды, и 48 последовательностей, кодирующих пептиды CLE. Для большинства последовательностей были идентифицированы их ближайшие гомологи в геноме люцерны слабоусеченной Medicago truncatula. С использованием информации, представленной в открытых базах данных (NCBI, EMBL) и экспрессионном атласе гороха был проведен анализ экспрессии выявленных генов в корнях, клубеньках, побегах, листьях и бобах гороха. Был выявлен кластер генов CLE у гороха, демонстрирующих специфичную экспрессию в клубеньках. Этот кластер включает гены PsCam040702 (PsCLE13), PsCam040984 (PsCLE12-like), PsCam041632 (PsNIC-like), которые являются ближайшими гомологами тех генов CLE, для которых ранее была продемонстрирована роль в регуляции клубенькообразования у других бобовых растений.
На следующем этапе был оценен уровень экспрессии генов PsCam040702 (PsCLE13), PsCam041632 (PsCLE12), PsCam040984 (PsCLE12-like) и PsCam041632 (PsNIC-like) в развивающихся примордиях клубеньков у гороха линии Frisson на 7 и 14 день после инокуляции ризобиями с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для всех проанализированных генов были выявлены относительно высокие уровни экспрессии в формирующихся клубеньках, по сравнению с неинокулированными корнями. Далее, была проанализирована экспрессия генов CLE в ответ на обработку нитратом (10 mM KNO3) в течение 24 часов. Экспрессия генов PsCam041632 (PsCLE12) и PsCam041632 (PsNIC-like) усиливалась при обработке нитратом, тогда как значительных изменений в уровнях экспрессии гена PsCam040984 при нитратной обработке по сравнению с контролем обнаружено не было. Согласно полученным данным, экспрессия генов PsCam041632 (PsCLE12) и PsCam041632 (PsNIC-like) усиливается при добавлении нитрата в 5,5, 2,5 и 5 раз, соответственно.
Среди генов люцерны для более детального изучения характера экспрессии и функции были выбраны два гена, MtCLE34 и MtCLE35, которые, согласно полученным нами данным, экспрессируются в развивающихся клубеньках. При этом, при обработке нитратом (10 mM KNO3) в течение 24 часов наблюдалось значительное увеличение экспрессии генов MtCLE34 и MtCLE35 (в среднем в 57 и 25 раз, соответственно), по сравнению с контролем, хотя экспрессия генов MtCLE12 и MtCLE13, специфичных для клубеньков, не изменялась значительно при обработке нитратом.
Для исследования роли генов CLE и CEP в развитии симбиотических клубеньков у люцерны и гороха на данном этапе были созданы конструкции для их сверхэкспрессии. Кодирующие области генов люцерны MtCLE34, MtCLE35, MtCEP17 MtCEP16, а также генов гороха PsCam040702 (PsCLE13), PsCam041632 (PsCLE12), PsCam040984 (PsCLE12-like) и PsCam041632 (PsNIC-like) были клонированы в векторах ввода pDONR221 или pDONR207, секвенированы, и затем помещены с помощью клонирования Gateway в вектор назначения pB7WG2D под контроль конститутивного промотора 35S.

Key findings for the stage (summarized)

С использованием данных секвенирования геномов четырех линий гороха были идентифицированы гены, кодирующие пептиды CLE и CEP, и описано их разнообразие. Были найдены 15 последовательностей гороха, кодирующих CEP-пептиды, и 48 последовательностей, кодирующих пептиды CLE. Для большинства последовательностей были идентифицированы их ближайшие гомологи в геноме люцерны слабоусеченной Medicago truncatula. С использованием информации, представленной в открытых базах данных (NCBI, EMBL) и экспрессионном атласе гороха был проведен анализ экспрессии выявленных генов в корнях, клубеньках, побегах, листьях и бобах гороха.
С помощью количественной ПЦР в реальном времени был оценен уровень экспрессии серии генов CLE гороха в развивающихся примордиях клубеньков на 7 и 14 день после инокуляции ризобиями, а также в корнях растений в ответ на обработку нитратом (10 mM KNO3) в течение 24 часов. Были выявлены гены, экспрессия которых усиливалась при обработке нитратом либо оставалась неизменной. Таким образом, у гороха выявлены нитрат-чувствительные гены, кодирующие пептидные гормоны CLE. С использованием того же подхода были выявлены нитрат-чувствительные гены CLE и у люцерны слабоусеченной.
Для исследования роли генов CLE и CEP в развитии симбиотических клубеньков у люцерны и гороха на данном этапе были созданы генетические конструкции для их сверхэкспрессии.
Полученные данные будут использованы для построения схемы регуляции клубенькообразования у бобовых растений в зависимости от азотного статуса растений. В дальнейшем, полученные результаты могут быть использованы для создания улучшенных сортов бобовых.

Academic ownership of participants (text description)

1. Жуков Владимир Александрович – 30%; нет.
2. Лебедева Мария Александровна – 30%; нет.
3. Додуева Ирина Евгеньевна – 5%; нет.
4. Жернаков Александр Игоревич – 10%; нет.
5. Штарк Оксана Юрьевна – 5%; нет.
6. Кулаева Ольга Алексеевна – 10%; нет.
7. Яшенкова Ярославна Сергеевна – 5%; нет.
8. Дворникова Кристина Алексеевна – 5%; нет.

Transfer of the full copy of the report to third parties for non-commercial use: permitted/not permitted

не разрешается

Check of the report for improper borrowing in external sources (plagiarism): permitted/not permitted

не разрешается
Short titleGZ-2020
AcronymМ1_2020 - 1
StatusFinished
Effective start/end date22/06/2031/12/20