Гетероциклические моно- и диацетилены для получения новых веществ с противоопухолевой активностью и соединений для оптического биоимиджинга: 2021 г. этап 1

Project: Grant fulfilmentGrant stage fulfilment

Project Details

Layman's description

По направлению дизайна и синтеза гетероциклических аналогов природных ендииновых антибиотиков на основании результатов биологических исследований полученных модельных бензотиофенсопряженных 10-членных О-,N-,C-ендиинов установлено, что наибольшей антипролиферативной активностью в ряду обладает азаендиин, что коррелирует с данными расчетов с применением молекулярного докинга, выявившими для этой структуры наибольшее сродство с малой бороздкой ДНК. Наименее активным в ряду оказался С-ендиин, который по данным докинга является лучшим интеркалятором.
Для дальнейшего направленного дизайна гетероциклических аналогов природных ендиинов проведены расчеты методом молекулярного докинга для определения влияния как природы аннелированного гетероцикла так и природы ендиинового кора на характер связывания с ДНК. В первой серии расчеты выполнены для двенадцати оксаендиинов, аннелированных с пяти- и шестичленными S-, O, N-гетероциклами, как с незамещенными, так и имеющими различные заместители в аннелированном гетерцикле. Полученные расчетные данные позволяют сделать вывод, что на характер связывания большее влияние оказывает не природа гетероцикла, а общая геометрия молекулы: незамещенный по гетероциклическому фрагменту ендиин лучше укладывается и связывается с малой бороздкой, тогда как наличие заместителей в гетероцикле цикле меняет характер связывания в сторону интеркаляции. Данные докинга для десяти карбо-, тиа- и азаендиинов, сопряженных с бензотиофеном, позволяют заключить, что именно аза- ендиины имеют большую способность связываться с малой бороздкой, а не интеркалировать, а введение заместителя к атому азота, имеющего структурное сходство с лигандами малой бороздки, существенно повышает энергетическую выгодность укладки в малую бороздку ДНК. Проведенные исследования позволили выбрать для дальнейшей модификации азаендиин, сопряженный с незамещенным в ядре бензотиофеном, в качестве удобной и эффективной базовой структуры.
Наряду с циклическими аналогами природных ендиинов скрининг ДНК-повреждающего и цитотоксического действия был проведен для обширной серии ациклических ендиинов, сопряжённых с различными гетероциклическими ядрами (бензотиофеном, индолом, триазолом) и с различной природой заместителей на концах ендииновой системы. В результате оценки цитотоксического действия синтезированных ендиинов триазольного ряда, а также их предшественников — 5-иод-4-этинил1,2,3- триазолов, на 5 линиях раковых клеток (A549, T98G, MDA-MB-231, Caki-2, MC F7) были выявлены три соединения- хита, что показывает перспективность развития этого направления.
По направлению поиска и создания новых реагентов для биоимиджинга разработан новый тип флуорогенного и флуорохромного зонда, основанный на восстановлении слабо флуоресцирующего 4-азидо-6-(4-цианофенил)циннолина до соответствующего флуоресцирующего циннолин-4-амина. Мы обнаружили, что на флуоресценцию 6-(4-цианофенил)циннолин-4-амина сильно влияет природа растворителя. Флуорогенный эффект для амина обнаружен в полярных растворителях с наиболее сильным увеличением флуоресценции в воде. Чувствительные к окружающей среде флуорогенные свойства циннолин-4-амина в воде были объяснены комбинацией двух типов флуоресцентных механизмов: эмиссии, вызванной агрегацией (AIE) и межмолекулярного переноса протонов в возбужденном состоянии (ESPT). Применение пары азид-амин в качестве флуорогенного зонда было протестировано in vivo с использованием раковой клеточной линии HepG2 с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и ВЭЖХ-анализа клеточных лизатов. Полученные результаты подтверждают возможность превращения азида в амин в клетках и потенциальную применимость обнаруженного флуорогенного и флуорохромного зонда для различных аналитических и биологических применений в водной среде. Результаты исследования опубликованы в Molecules, 2021, 26(24), 7460.
Для расширения возможностей молекулярного дизайна и настройки фотофизических свойств циннолин-4-аминов показана возможность функционализации по 6-му положению циннолинового ядра с помощью реакции Сузуки-Мияуры 6-бромциннолин-4-амина в качестве базовой структуры, что дает дивергентный подход к получению подобных структур.
Для создания принципиально новых эффективных SPAAC реагентов для биоконъюгации: активных, стабильных и легкодоступных при получении, нами были предложены неизвестные ранее гетероциклононины, имеющие в своем составе гетероатом (азот, кислород или серу) и конденсированные с гетероциклами. Как часть масштабной задачи в рамках проекта осуществлен синтез нового SPAAC реагента для биоимиджинга - азациклононина, сопряженного с изокумарином, модифицированного через атом азота циклоалкинового цикла флуоресцентным красителем BDP-FL (IC9N-BDP-FL). С использованием клеток HEK293, содержащих метаболически меченые азидо-гликаны или азидо-ДНК показано, что флуоресцентное мечение как гликанов, так и ДНК было специфическим. С помощью МТТ-анализа также было продемонстрировано, что IC9N-BDP-FL нетоксичен для клеток, культивируемых до 12 часов, что достаточно для завершения реакции SPAAC в живых клетках. Таким образом созданный реагент имеет хороший потенциал для визуализации пролиферирующих клеток и дальнейшего количественного определения флуоресцентно меченых клеток с использованием анализа изображений и проточной цитометрии. Результаты масштабной работы были опубликованы в JACS, 2021 143 (40), 16519.
В рамках настоящего проекта также решалась задача, связанная с разработкой нового метода получения ендииновых систем, конденсированных с гетероциклами. Была изучена возможность использования подхода, основанного на иод-промотируемых циклизациях иодэтиниларенов с образованием 2,3-диодгетероциклов и последующем постадийном региоселективном замещении атомов иода на этинильные фрагменты при помощи реакции Соногаширы. Эффективность нового пути синтеза ендииновых систем была продемонстрирована на примере синтеза 2,3-дииодбензотиофена, для которого были подобраны условия региоселективного замещения атома иода в положении С2 в условиях реакции Соногаширы.

Key findings for the stage (summarized)

Важнейшие результаты, полученные по направлению дизайна и синтеза гетероциклических аналогов природных ендииновых антибиотиков
Проведено исследование влияния бензотиофен-сопряженных 10-членных О-,N-,C-ендиинов на способность клеток пролиферировать (использованы клеточные линии pancreatic ductal adenocarcinoma (PANC-1) human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19) и human embryonic kidney (HEK293)). На основании результатов биологических исследований и расчетов с применением молекулярного докинга установлено, что наибольшей антипролиферативной активностью в ряду обладает N-ендиин, что коррелирует с данными докинга, показавшем его наибольшее сродство с малой бороздкой ДНК. Квантовохимические расчеты энергий активации для оценки активности ендиинов в циклизации Бергмана не коррелирую напрямую с данными по биологической активности и решающим в этом случае является тип связывания с молекулой ДНК, что можно оценить с помощью расчетов методом молекулярного докинга.
Расчеты методом молекулярного докинга связывания с ДНК были выполнены для двенадцати модельных 10-членных O-ендиинов, отличающихся природой аннелированного гетероцикла (пяти- и шестичленные S-, O, N-гетероциклы). При этом рассматривались оксаендиины, аннелированные как с незамещенными гетероциклами, так и гетероциклами, имеющими в качестве заместителей сложноэфирную, метокси- или метильную группы. На основании проведенных расчетов установлено, что в большинстве случаев ендиины с незамещенным гетероциклом проявляют большее сродство к малой бороздке ДНК, а введение заместителя (в основном COOMe) в гетероцикл, делает более выгодным и с точки зрения скоринг-функции, и по энергии ΔG связывание по механизму интеркаляции. Таким образом, полученные расчетные данные позволяют сделать вывод, что на характер связывания большее влияние оказывает не природа гетероцикла, аннелированного с бензольным ядром, а общая геометрия молекулы: незамещенный по гетероциклическому фрагменту ендиин лучше укладывается и связывается с малой бороздкой, тогда как замещение атома водорода в приконденсированном цикле меняет характер связывания в сторону интеркаляции.
Исследования методом молекулярного докинга влияния природы ендиинового кора на характер связывания с ДНК, проведенные для серии из 10 карбо-, тиа- и азаендиинов, сопряженных с бензотиофеном, позволяют заключить, что N-замещенные ендиины имеют большую способность связываться именно с малой бороздкой, а не интеркалировать. При этом введение заместителя, имеющего структурное сходство с лигандами малой бороздки, существенно повышает энергетическую выгодность укладки в малую бороздку ДНК. На основании совокупности полученных на этом этапе данных в качестве удобной базовой структуры, эффективной для дальнейшей модификации был выбран 10-членный азаендиин, сопряженный с бензотиофеном. Атом азота в ендииновом цикле может быть использован в качестве сайта для получения конъюгатов с полиамидами, углеводами и лигандами к малой бороздке.
Наряду с циклическими аналогами природных ендиинов скрининг ДНК-повреждающего и цитотоксического действия был проведен для обширной серии ациклических ендиинов, сопряжённых с различными гетероциклическими ядрами (бензотиофеном, индолом, триазолом) и с различной природой заместителей на концах ендииновой системы. Данные исследования выявили два ациклических ендиина, сопряженных с тиофеном, способных вызывать 1-нитивые разрывы pBR322 плазмиды ДНК.
В результате оценки цитотоксического действия синтезированных ендиинов триазольного ряда, а также их предшественников - 5-иод-4-этинил1,2,3- триазолов, на 5 линиях раковых клеток (A549, T98G, MDA-MB-231, Caki-2, MC F7) были выявлены три соединения- хита, что показывает перспективность развития этого направления, в том числе, изучения механизма антипролиферативного действия.
Важнейшие результаты, полученные по направлению поиска и создания новых реагентов для биоимиджинга.
Разработан новый тип флуорогенного и флуорохромного зонда, основанный на восстановлении слабо флуоресцирующего 4-азидо-6-(4-цианофенил)циннолина до соответствующего флуоресцирующего циннолин-4-амина. Выявлено, что на флуоресценцию 6-(4-цианофенил) циннолин-4-амина сильно влияет природа растворителя. Флуорогенный эффект для амина был обнаружен в полярных растворителях с наиболее сильным увеличением флуоресценции в воде. Флуорогенные свойства циннолин-4-амина в воде были объяснены как комбинация двух типов механизмов флуоресценции: эмиссия, индуцированная агрегацией (AIE) и межмолекулярный перенос протона в возбужденном состоянии (ESPT). Пригодность пары азид-амин в качестве флуорогенного зонда была протестирована с использованием линии клеток рака печени HepG2 с детектированием с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и ВЭЖХ-анализа клеточных лизатов. Полученные результаты подтверждают возможность превращения азида в амин в клетках. В результате проведенных исследований циннолин-4-амин можно рассматривать как новый чувствительный к окружению флуоресцентный зонд, превращение азидоциннолина в соответствующий амин может быть перспективным для развития различных сенсорных систем, включая биосенсорные. Разработанный синтетический подход открывает путь к поиску и созданию новых цинниолин-4-аминов с оптимальными фотофизическими свойствами для конкретных биологических приложений (Molecules, 2021, 26(24), 7460; doi.org/10.3390/molecules26247460 (Q1) Chemistry (miscellaneous)).
Как часть масштабной задачи по созданию новых эффективных реагентов для биоимиджинга и биоконъюгации, нами были предложены в качестве SPAAC реагентов неизвестные ранее гетероциклоалкины, имеющие в своем составе гетероатом (азот, кислород или серу) и конденсированные с гетероциклами; высказана гипотеза о согласованном влиянии стерических факторов и стереоэлектронных эффектов на баланс реакционной способности и стабильности, подтвержденная расчетами и синтезом соответствующих структур. В рамках настоящего проекта был осуществлен синтез нового SPAAC реагента для биоимиджинга - азациклононина, сопряженного с изокумарином, модифицированного через атом азота циклоалкинового цикла флуоресцентным красителем BDP-FL (IC9N-BDP-FL). Чтобы проанализировать специфическую способность IC9N-BDP-FL к введению флуоресцентных меток, использовали клетки HEK293, содержащие метаболически меченые азидо-гликаны и азидо-ДНК. Флуоресцентный сигнал удалось получить в обоих экспериментах. Применение IC9N-BDP-FL для флуоресцентного окрашивания метаболически меченой азидо-ДНК имеет хороший потенциал для визуализации пролиферирующих клеток и дальнейшего количественного определения флуоресцентно меченых клеток с использованием анализа изображений и проточной цитометрии. Кроме того, липофильный IC9N-BDP-FL может быть применен для визуализации внутриклеточных гликанов и анализа путей, которые регулируются посттрансляционными модификациями гликанов, а также для мониторинга самого процесса внутриклеточного гликозилирования в живых клетках (JACS, 2021 143 (40), 16519-16537 DOI: 10.1021/jacs.1c06041ACS (Q1)).
В рамках настоящего проекта также решалась задача, связанная с разработкой нового метода получения ендииновых систем, конденсированных с гетероциклами. Была изучена возможность использования подхода, основанного на иод-промотируемых циклизациях иодэтиниларенов с образованием 2,3-диодгетероциклов и последующем постадийном региоселективном замещении атомов иода на этинильные фрагменты при помощи реакции Соногаширы. Этот способ является альтернативой разработанному ранее методу, основанному на иодоциклизации орто-функционализированных арилдиацетиленов с последующей реакцией Соногаширы. Эффективность нового пути синтеза ендииновых систем была продемонстрирована на примере синтеза 2,3-дииодбензотиофена, для которого были подобраны условия региоселективного замещения атома иода в положении С2 в условиях реакции Соногаширы. Попытки получения этим же методом 6-членных дииодгетероциклов: 1,2-тиазин-1,1-диоксидов, изохроменов и изохинолинов привели исключительно к продуктам 5-экзо-диг-циклизации. В то же время полученные в этом случае дииодметилиденгетероциклы представляют интерес для дальнейшей модификации с помощью реакции кросс-сочетания с целью создания новых молекул с флуоресцентными свойствами.

Academic ownership of participants (text description)

Балова Ирина Анатольевна, директор Института химии СПбГУ. Постановка задач, анализ и осуждение полученных результатов, корректировка задач в процессе выполнения проекта, подготовка к публикации обзора, статей и отчета по гранту.
Данилкина Наталья Александровна, доцент кафедры органической химии СПбГУ. Выбор методов синтеза, синтез, поиск и апробация оптимальных условий проведения реакций для получения макроциклических азаендиинов конденсированных с индолом и бензофураном, изучение физико-химических свойств, экспериментальное определени активационных параметров для циклизации Бергмана ендииновых макроциклов при помощи кинетических измерений, сравнение с теоретическими данными, корректировка шкалы. Подготовка экспериментальных данных для публикации, написание статей, участие в составлении отчета.
Рязанцев Михаил Николаевич, доцент кафедры лазерной химии и лазерного материаловедения СПбГУ. Выбор методик и алгоритмов, проведение квантово-химических расчетов для определения активационных параметров гетероциклических ендиинов в циклизации Бергмана, исследование связывания с ДНК методами молекулярного докинга. Анализ полученных результатов, корректировка задач, подготовка материалов для публикации и отчета.
Михайлов Владимир Николаевич, доцент кафедры органической химии СПбГУ. Синтез и характеризация комплексов палладия(II) и меди(I), исследование каталитической активности синтезированных комплексов и природы катализа. Синтез и исследование циннолин-4-аминов. Участие в подготовке публикаций и годового отчета.

Transfer of the full copy of the report to third parties for non-commercial use: permitted/not permitted

не разрешается

Check of the report for improper borrowing in external sources (plagiarism): permitted/not permitted

разрешается
AcronymRSF_RG_2021 - 1
StatusFinished
Effective start/end date26/04/2131/12/21

Fingerprint

Explore the research topics touched on by this project. These labels are generated based on the underlying awards/grants. Together they form a unique fingerprint.