Выявление мутаций, влияющих на амилоидогенез пептида Abeta42, и изучение механизма их эффектов: 2020 г. этап 2

Project: Grant fulfilmentGrant stage fulfilment

Project Details

Description

Целью проекта является выявление мутаций, влияющих на амилоидогенез пептида Abeta42 (связанного с болезнью Альцгеймера), и изучение механизма их эффектов.
Учитывая динамику роста болезни Альцгеймера в мире (по прогнозам Всемирного общества болезни Альцгеймера к 2030 г. ожидается более 150 млн. больных) если в ближайшее время не будут разработаны методы лечения болезни Альцгеймера, уже в следующем поколении она может выйти на первое место как главная причина смертности в человеческих популяциях. Решение проблемы болезни Альцгеймера является ключевым пунктом в общей проблеме обеспечения нормального функционирования человеческого общества в условиях увеличения продолжительности жизни и общего старения человеческой популяции.
В Задачи проекта входит:
1. Получить данные о мутациях в пептиде Abeta42, снижающих или усиливающих нуклеацию амилоида в дрожжевой модели.
2. Провести анализ эффектов выявленных мутаций на структуру амилоида в соответствии со структурными моделями для Abeta42 и предсказаниями существующих компьютерных алгоритмов.
3. Получить данные об агрегации мутантных вариантов Abeta42 с использованием цитологических и биохимических методов
4. Получить данные о взаимодействии и взаимных эффектах различных мутаций в Абета42.
5. Исследовать эффекты, выявленные в дрожжах мутаций Abeta42, in vitro и на модели клеток человека.
6. Исследование эффектов взаимодействия и взаимного влияния различных мутаций в Abeta42.
7. Определить последовательности пептидов, потенциально блокирующих нуклеацию амилоида Abeta42.
Для поиска мутаций, влияющих на амилоидогенез пептида Abeta42 человека, в проекте будет применена разработанная руководителем проекта Ю.О. Черновым и его коллегами оригинальная дрожжевая тест-система для выявления амилоидогенных свойств белков млекопитающих (Chandramowlishwaran et al., 2018).
Для конструирования библиотеки челночных плазмид с конструкцией SUP35N-Abeta42, содержащих мутагенизированные варианты Abeta42 будет проведён мутагенез методом ПЦР.
Мутантные варианты Abeta42, выявленные при скрининге в дрожжевой тест-системе, в дальнейшем будут проверены биохимическим анализом (с использованием метода полуденатурирующего агарозного гель электрофореза, SDD-AGE, см. Kryndushkin et al., 2003) и цитологическим анализом с использованием флуоресцентной микроскопии и конструкций, содержащих пептид Abeta, слитый с флуорофором YFP или CFP (амилоидная агрегация таких конструкций в клетках дрожжей была продемонстрирована нами ранее, см. Rubel et al., 2013). Для того чтобы исключить эффекты, специфичные только для клеток дрожжей, наиболее перспективные мутации, выявленные в фенотипическом скрининге в дрожжах, будут проверены в культуре клеток нейробластомы человека. Для этого будут получены генетические конструкции, в которых последовательность, кодирующая мутантный вариант Abeta42 будет слита с белками YFP/CFP.
Позиции идентифицированных мутаций будут сопоставлены со структурными моделями Abeta42 (например, Walti et al., 2016). Будет также проведён анализ потенциальных эффектов мутаций на амилоидогенез с использованием компьютерных алгоритмов, таких как ArchCandy, Aggrescan, AmylPred, Waltz (см. обзор Wilson et al., 2018 ).
Амилоидные фибриллы Abeta42 представляют собой кросс-бета полимеры нековалентного димера (Walti et al., 2016). Мутации, влияющие на процесс амилоидизации Abeta42, могут действовать на разные этапы в формировании амилоида: а) возникновение нековалентного димера; б) формирование кросс-бета структур; в) стабильность кросс-бета олигомера; г) иммобилизацию новых молекул и рост олигомера в амилоидную фибриллу. Возникающие в результате продукты будут выявлены с помощью анализа мутантных конструкций in vivo. Физическое взаимодействие между мутантными пептидами Abeta (а также между мутантным пептидом и пептидом дикого типа) будет исследовано с помощью метода FRET (Forster resonance energy transfer) (для конструкций, содержащих разные флуорофоры). Применимость этого подхода к анализу взаимодействий между амилоидами (включая Abeta) в клетках дрожжей была продемонстрирована нами ранее (Rubel et al., 2013). В случае, если наш анализ выявит новые мутации, эффекты которых не объясняются существующими структурными моделями, детальная характеристика эффекта этих мутаций на структуру амилоида может быть проведена с использованием методов ЯМР и крио-электронной микроскопии. Ресурсные центры СПбГУ располагают инфраструктурой и всем необходимым для проведения таких исследований оборудованием.
В числе полученных мутантных вариантов Abeta со сниженной нуклеацией амилоида мы рассчитываем получить варианты с доминантным эффектом, которые будут блокировать амилоидизацию пептида Abeta дикого типа. Это возможно в ситуации, когда мутантный пептид способен образовать димер с пептидом дикого типа, или включаться в состав кросс-бета олигомера, но при этом блокирует присоединение новых молекул пептида Abeta через кросс-бета связи. Возможно также дальнейшее усиление свойств антиамилоидных пептидов с помощью конструкции укороченных и-или модифицированных вариантов, которые будут проверены в описанных выше экспериментальных системах. Доминантные амилоидные пептиды представляют наибольший интерес для наших исследований, поскольку в потенциале, они могут быть использованы в терапевтических целях. Abeta способен проходить гематоэнцефалический барьер, поэтому ввод мутантных пептидов в организм возможен как путём инъекций, так и с использованием экспрессионных конструкций (генотерапии).
AcronymRFBR_Sirius_2019 - 2
StatusActive
Effective start/end date30/11/2028/10/21